Blockade von Programmiertem Zelltod mit rekombinanten Proteinen

Für die Intervention mit den Signalwegen des programmierten Zelltods (PCD) stehen zahlreiche molekularbiologische Methoden und Wirkstoffe zur Verfügung. Neben induzierbaren Genexpressionssystemen kommen diverse Biomoleküle wie Peptide, Aptamere oder siRNAs als potentielle Zielstrukturen therapeutischer Behandlungen in Frage. Auf Grund der hohen Spezifität und steuerbaren Bioverfügbarkeit ist der direkte Einsatz rekombinanter Proteine aus klinischer Sicht eine ideale Alternative zu den zuvor genannten Möglichkeiten. Neben dem Enterobakterium Escherichia coli werden in unserem Labor eukaryontische Zellen wie CHO für die Expression solcher Proteine genutzt, wobei die Notwendigkeit posttranslationaler Modifikationen die Wahl des Expressionssytem entscheidend mitbestimmt. Die Auswahl der dabei in Frage kommenden Proteine  leitet sich vom molekularen Verständnis der Signalwege des PCD ab. Die Anwesenheit reaktiver Sauerstoffverbindungen (ROS) ist kausal verantwortlich für zahlreiche klinisch relevante Ereignisse. Ischämie/Reperfusionsschäden wie sie beim akuten Nierenversagen oder nach Transplantationen vorkommen, sind die Folge von oxidativem Stress, der in unkompensierter Form zum PCD führt. Durch die direkte passagere Bereitstellung protektiver bzw. suppressiv-wirkender Proteine wollen wir das Ausmaß dieser Schäden und die daraus resultierenden Beeinträchtigungen für den Gesamtorganismus maximal reduzieren. Zentrale Proteine des PCD bzw. einzelne essentielle Moleküldomänen werden mit Zielstrukturen wie His-Tag, MBP oder GST versehen. Letztere ermöglichen eine hochspezifische Aufreinigung der rekombinanten Proteine mittels Affinitätschromatographie (siehe Abbildung). Der intrazelluläre Transfer der rekombinant hergestellten Moleküle wird durch Fusion mit einer Proteintransduktionsdomäne (PTD) ermöglicht, wobei die TAT-Domäne vom HIV-1 als die effektivste angesehen wird.

 

Die biologische Aktivität der rekombinanten Proteine wird primär unter Verwendung stabiler Zelllinien oder frisch isolierter MEFs unter Verwendung entsprechender Zelltod-Assays in vitro bestimmt. Erst nach erfolgreichem Nachweis gezielter Blockade relevanter Zelltod-Prozesse erfolgt ein Transfer in präklinische PCD-Modelle. Da in vivo größere Proteinmengen eingesetzt werden müssen, wird im Labor viel Aufwand zur Verbesserung der Proteinexpression und Aufreinigung verwendet, um die Ausbeute an funktionellen Proteinen zu erhöhen. Dieser Prozess muss dabei für jedes einzelne Protein optimiert werden. Eine Übersicht der bisher erfolgreich hergestellen und in vivo eingesetzten TAT-Proteine finden Sie hier.